编号:ISH-5136

说明书
产品名称:

HPV31/33杂交试剂盒


详细信息:
规  格:探针800ul
产品简介:1.1 原理:人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一种嗜上皮性病毒,在人和动物中分布广泛,有高度的特异性。HPV感染除了性行为是主要传播途径以外,还可以通过间接接触感染。目前已经确定的HPV型别大约有100余种,依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危型和高危型HPV,低危型包括HPV6、11、42、43、44等型别,常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内瘤变(CIN I),高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别,与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN II/III)的发生相关,尤其是HPV16和18型。
本试剂盒采用辣根过氧化物酶系统,显色剂为DAB,具有以下特点:DNA探针,敏感性强;胃酶消化,稳定可靠。
1.2 试剂盒内容物:
试剂1 胃酶消化液(即用型) 3毫升
试剂2 地高辛标记HPV 31/33 DNA探针* 800微升
试剂3 杂交后洗液 12毫升
试剂4 抗地高辛抗体 3毫升
试剂5 HRP多聚体 3毫升
试剂6 A DAB稀释液 10毫升
试剂6 B DAB浓缩液(20×) 0.5毫升
试剂7 PBS缓冲液 1000毫升×3袋
试剂8 Tween 20 1.5毫升
A盒 防脱玻片 1盒
B盒 硅化盖玻片 1盒
1.3 储存和保质期
─ 所有试剂2-6℃保存,稀释后的PBS溶液2-6℃保存
─ 请按照说明书要求使用和保存试剂,可保证试剂盒在有效期内的稳定性
1.4 注意事项
─ 使用前请仔细阅读产品说明书,不要使用已经过期的试剂
─ 使用前,请将所有的试剂恢复至室温(20-25℃),探针在使用前请混匀
─ 请勿将试剂盒中的产品用其它厂商的产品替代
1.5预先准备的试剂
PBS配制:将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水,彻底溶解后加入Tween 20 5滴,混匀后使用。
DAB工作液配制:在1毫升6A中加入50微升的6B,临用前配制,未用完的液体应弃去。也可按照上述比例,根据实际需要量配制。
检测步骤:所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行,避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始,玻片不能干燥。
2.1样品的收集和预处理
石蜡切片:
常规福尔马林缓冲液固定,时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65℃。4-6 m的石蜡切片,56-60℃烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用,也可放置于室温条件下保存(至少可保存3个月以上)。在做原位杂交之前,切片需经二甲苯脱蜡(10分钟×2)。脱蜡后的切片在100%乙醇中放置5分钟后,经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。
2.2酶处理
每张切片加入适量胃酶工作液37℃孵育,30分钟。
弃去胃酶工作液后,逐级酒精脱水(70%、95%和100%),每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。
2.3变性杂交程序
变性杂交:
混匀探针溶液,在每张切片上加10-20 l适量的探针(试剂2),加盖盖玻片(注意防止气泡!)。原位杂交仪中95℃变性5分钟(注意:一定要保证在此温度条件下变性5分钟,也可以适当延长时间至7-8分钟),37℃杂交2~4小时或过夜(注意杂交温度最低为室温最高应为37℃)。
冲洗:
1. 将切片浸入PBS缓冲液中,直到盖玻片自然脱落,用PBS缓冲液冲洗切片10分钟。
2. 在每张切片上加入1滴杂交后洗液(试剂3),37℃孵育15分钟。PBS缓冲液冲洗2分钟×3次。
2.4检测和显色程序
1. 在切片上加入适量抗地高辛抗体(试剂4),37℃孵育30分钟,PBS冲洗2分钟×3次。
2. 在切片上加入适量HRP多聚体(试剂5),37℃孵育30分钟,PBS冲洗2分钟×3次。
3. 在切片上加入适量DAB工作液,镜下观察显色情况,显色充分后用自来水终止。

2.5复染程序
可选择苏木素复染,染色约5-10秒。用蒸馏水或去离子水短时间冲洗,常规脱水、透明,封片。
常见问题处理对策:1 脱片:
可能原因 对 策
标本制作 固定剂是否选用福尔马林缓冲液,切片是否确实干片。
组织切片过薄 切片合适的厚度为4-6 m
玻片使用不当 必须使用有机硅包被的玻片
胃酶浓度过高 确定是否按照组织类型使用合适的酶浓度
消化时间过长 减少消化时间或消化温度改为室温
2 预想的阳性切片,实验结果为弱阳性或阴性
可能原因 对 策
组织固定 固定剂只能选用福尔马林缓冲液
脱蜡 选用新鲜的脱蜡液
消化 确定胃酶使用的浓度是否正确 温度是否为37℃
变性杂交程序 确定探针在使用前是否混匀,变性温度、时间是否正确
检测程序 确定温度是否为37℃
靶DNA含量过低 可以选用杂交过夜
3 阴性对照切片阳性染色
可能原因 对 策
干片 应在湿盒中进行杂交
阳性对照探针/特异性探针污染 确定为新使用探针

4 非特异性背景染色
可能原因 对 策
干片 在潮湿的环境中进行杂交
内源性碱性磷酸酶 在底物溶液中加入4mg levamisol
实验步骤指南:石蜡切片预处理 孵育时间
1、4-6 m切片,用防脱处理过的切片捞片
2、烤片 56-60℃ 2-16小时
3、新鲜二甲苯脱蜡 2×10分钟
4、100%乙醇后空气干燥 2×5分钟
酶处理
1、滴加适量胃酶工作液 37℃ 30分钟
2、弃去胃酶工作液,逐级酒精脱水、空气干燥 3×1分钟
变性杂交程序
1、加10-20 l探针/切片,加盖玻片
2、变性 95℃ 5-7分钟
3、杂交 37℃ 2小时/过夜
4、切片插入PBS缓冲液中以便去掉盖玻片 约5-10分钟
5、每张切片加入2-3滴杂交后洗液 37℃ 15分钟
6、PBS缓冲液洗 3×2分钟
检测和染色程序
1、每张切片加入适量抗地高辛抗体 37℃ 30分钟
2、PBS缓冲液冲洗 3×2分钟
3、每张切片加入适量HRP多聚体 37℃ 30分钟
4、PBS缓冲液冲洗 3×2分钟
5、每张切片加入适量DAB工作液,弃去显色液,蒸馏水或自来水冲洗 5-10分钟
6、选择:每张切片加入1滴复染剂 5-10秒钟
7、蒸馏水或自来水冲洗,脱水、透明、封片、镜检
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