编号:ISH-5164

说明书
产品名称:

HPV定型


详细信息:
规  格:探针各800ul
产品简介:1.1 原理:人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一种嗜上皮性病毒,在人和动物中分布广泛,有高度的特异性。HPV感染除了性行为是主要传播途径以外,还可以通过间接接触感染。目前已经确定的HPV型别大约有100余种,依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危型和高危型HPV,低危型包括HPV6、11、42、43、44等型别,常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内瘤变(CIN I),高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别,与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(CIN II/III)的发生相关,尤其是HPV16和18型。
本试剂盒采用辣根过氧化物酶系统,显色剂为DAB,具有以下特点:DNA探针,敏感性强;胃酶消化,稳定可靠。
1.2 试剂盒内容物:
试剂1 胃酶 1克
试剂2 1N盐酸 15毫升
试剂3A 地高辛标记HPV6/11 DNA探针 800微升
试剂3B 地高辛标记HPV16/18 DNA探针 800微升
试剂3C 地高辛标记HPV31/33 DNA探针 800微升
试剂4 杂交后洗液 15毫升×2
试剂5 抗地高辛抗体 15毫升
试剂6 HRP多聚体 15毫升
试剂7 A DAB稀释液 20 毫升
试剂7 B DAB浓缩液(20×) 1毫升
试剂8 PBS缓冲液 1000毫升×5袋
试剂9 Tween 20 2毫升
A盒 防脱片 2盒
B盒 硅化盖玻片 100片
1.3 储存和保质期
─ 所有试剂2-6℃保存,稀释后的PBS溶液2-6℃保存
─ 溶解和分装的胃酶消化液-20℃保存,有效期至少1年以上
─ 请按照说明书要求使用和保存试剂,可保证试剂盒在有效期内的稳定性
1.4 注意事项
─ 使用前请仔细阅读产品说明书,不要使用已经过期的试剂
─ 使用前,请将所有的试剂恢复至室温(20-25℃),探针在使用前请混匀
─ 请勿将试剂盒中的产品用其它厂商的产品替代
1.5预先准备的试剂
胃酶浓缩液:将胃酶中加入4毫升的蒸馏水或去离子水,充分溶解后可根据使用量分装,冻存(-20℃)。
胃酶稀释液:石蜡切片:将试剂瓶中的1N HCl用蒸馏水或去离子水10倍稀释,即成0.1N HCl溶液
冷冻切片和细胞样品:将试剂瓶中的1N HCl用蒸馏水或去离子水100倍稀释,即成0.01N HCl溶液
PBS配制:将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水,彻底溶解后加入Tween 20 5滴,混匀后使用。
DAB工作液配制:在1毫升7A中加入50微升的7B,临用前配制,未用完的液体应弃去。也可按照上述比例,根据实际需要量配制。
1.6胃酶消化工作液的配制
每1cm2的切片按照300 l准备胃酶消化工作液,必须现用现配,未用完的胃酶工作液应弃去。
石蜡切片:将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCl溶液100倍稀释,例如可将50 l的分装胃酶浓缩液加入到5ml的0.1N HCl溶液中,混匀后备用。
细胞样品:将上述已分装好的胃酶浓缩试剂用已稀释至0.01N的HCl溶液25,000倍稀释,例如可将4 l的分装胃酶浓缩液加入到100ml的0.01N HCl溶液中,混匀后备用。
冷冻切片:将上述已分装好的胃酶浓缩试剂用已稀释至0.01N的HCl溶液50,000倍稀释,例如可将2 l的分装胃酶浓缩液加入到100ml的0.01N HCl溶液中,混匀后备用。
检测步骤:所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行,避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始,玻片不能干燥。
2.1样品的收集和预处理
石蜡切片:
常规福尔马林缓冲液固定,时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65℃。4-6 m的石蜡切片,56-60℃烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用,也可放置于室温条件下保存(至少可保存3个月以上)。在做原位杂交之前,切片需经二甲苯脱蜡(10分钟×2)。脱蜡后的切片在100%乙醇中放置5分钟后,经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。
细胞样品:
将细胞滴在防脱处理过的玻片上,应保证样品是单层细胞,室温干燥30分钟,用交联固定剂(如4%多聚甲醛)室温固定细胞10分钟,PBS冲洗,逐级乙醇脱水,空气干燥,进行酶处理。
冷冻切片:
将6 m厚的冷冻切片置于处理过的玻片上,干燥30分钟,用交联固定剂(如4%多聚甲醛)室温固定10分钟,PBS冲洗,逐级乙醇脱水,空气干燥,进行酶处理。
2.2酶处理
每张切片加入300 l新鲜配制的胃酶工作液37℃孵育。注意:石蜡切片孵育30分钟,细胞样品和冷冻切片孵育10分钟;各种切片所用的胃酶工作液浓度不一样。
弃去胃酶工作液后,逐级酒精脱水(70%、95%和100%),每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。
2.3变性杂交程序
变性杂交:
混匀探针溶液,在每张切片上加10-20 l适量的探针(试剂3),加盖盖玻片(注意防止气泡!)。原位杂交仪中95℃变性5分钟(注意:一定要保证在此温度条件下变性5分钟,也可以适当延长时间至7-8分钟),37℃杂交2~4小时或过夜(注意杂交温度最低为室温最高应为37℃)。
冲洗:
1. 将切片浸入PBS缓冲液中,直到盖玻片自然脱落,用PBS缓冲液冲洗切片10分钟。
2. 在每张切片上加入1滴杂交后洗液(试剂4),37℃孵育15分钟。PBS缓冲液冲洗2分钟×3次。
2.4检测和显色程序
1. 在切片上加入适量抗地高辛抗体(试剂5),37℃孵育30分钟,PBS冲洗2分钟×3次。
2. 在切片上加入适量HRP多聚体(试剂6),37℃孵育30分钟,PBS冲洗2分钟×3次。
3. 在切片上加入适量DAB工作液,镜下观察显色情况,显色充分后用自来水终止。

2.5复染程序
可选择苏木素复染,染色约5-10秒。用蒸馏水或去离子水短时间冲洗,常规脱水、透明,封片。
常见问题处理对策:1 脱片:
可能原因 对 策
标本制作 固定剂是否选用福尔马林缓冲液,切片是否确实干片。
组织切片过薄 切片合适的厚度为4-6 m
玻片使用不当 必须使用有机硅包被的玻片
胃酶浓度过高 确定是否按照组织类型使用合适的酶浓度
消化时间过长 减少消化时间或消化温度改为室温
2 预想的阳性切片,实验结果为弱阳性或阴性
可能原因 对 策
组织固定 固定剂只能选用福尔马林缓冲液
脱蜡 选用新鲜的脱蜡液
消化 确定胃酶使用的浓度是否正确 温度是否为37℃
变性杂交程序 确定探针在使用前是否混匀,变性温度、时间是否正确
检测程序 确定温度是否为37℃
靶DNA含量过低 可以选用杂交过夜
3 阴性对照切片阳性染色
可能原因 对 策
干片 应在湿盒中进行杂交
阳性对照探针/特异性探针污染 确定为新使用探针
4 非特异性背景染色
可能原因 对 策
干片 在潮湿的环境中进行杂交
内源性过氧化物酶 酶消化前用3% H2O2溶液室温孵育15分钟以灭火内源性过氧化物酶
实验步骤指南:石蜡切片预处理 孵育时间
1、4-6 m切片,用防脱处理过的切片捞片
2、烤片 56-60℃ 2-16小时
3、新鲜二甲苯脱蜡 2×10分钟
4、100%乙醇后空气干燥 2×5分钟
酶处理
1、稀释1N HCl 胃酶稀释液(试剂2)
2、用稀释后的HCl溶解分装胃酶,每张切片加入300-400 l稀释好的胃酶工作液,胃酶工作液稀释如下:
石蜡切片:0.1N HCl 100倍稀释,如20 l加入2毫升0.1N HCl中
细胞样品:0.01N HCl 25000倍稀释,如4 l加入100毫升0.01N HCl中
冷冻切片:0.01N HCl 50000倍稀释,如2 l加入100毫升0.01N HCl中

37℃ 30分钟
37℃ 10分钟
37℃ 10分钟
3、弃去胃酶工作液,逐级酒精脱水、空气干燥 3×1分钟
变性杂交程序
1、加10-20 l探针/切片,加盖玻片
2、变性 95℃ 5-7分钟
3、杂交 37℃ 2小时/过夜
4、切片插入PBS缓冲液中以便去掉盖玻片 约5-10分钟
5、每张切片加入2-3滴杂交后洗液 37℃ 15分钟
6、PBS缓冲液洗 3×2分钟
检测和染色程序
1、每张切片加入适量抗地高辛抗体 37℃ 30分钟
2、PBS缓冲液冲洗 3×2分钟
3、每张切片加入适量HRP多聚体 37℃ 30分钟
4、PBS缓冲液冲洗 3×2分钟
5、每张切片加入适量DAB工作液,弃去显色液,蒸馏水或自来水冲洗 5-10分钟
6、选择:每张切片加入1滴复染剂 5-10秒钟
7、蒸馏水或自来水冲洗,脱水、透明、封片、镜检
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