编号:ISH-6022-Y

说明书
产品名称:

EBER原位杂交试剂盒


详细信息:
规  格:探针1ml,检测系统4ml
产品简介:1.1 原理:EB病毒属疱疹科病毒,是一种人类特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒。通过密切接触传播,侵入门户通常是咽部的淋巴样组织,主要侵犯B淋巴细胞。EB病毒的感染广泛存在,除与鼻咽癌、传染性单核细胞增多症有关外,还同Burkitt淋巴瘤感染损伤患者的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性疲劳综合征、移植后淋巴组织增生症等有关。
EBER是EB病毒编码的小RNA,在EB病毒感染的细胞核中高拷贝存在。根据EBER的序列设计的EBER RNA探针,可以用于石蜡切片、冷冻切片、细胞涂片,具有较高的特异性和灵敏度,广泛应用于美国、欧盟等各国。
本试剂盒采用辣根过氧化物酶系统,显色剂为DAB,具有以下特点:CE认证产品;RNA探针,敏感性强;胃酶消化,稳定可靠;无需变性,37℃杂交即可;常温PBS洗涤;一步检测,DAB显色。
1.2 试剂盒内容物:
试剂1 胃酶工作液(即用型) 4毫升
试剂2 地高辛标记的EBER探针 1毫升
试剂3 HRP标记的抗地高辛抗体 4毫升
试剂4A DAB稀释液 10毫升
试剂4B DAB浓缩液(20×) 0.5毫升
试剂5 PBS缓冲液 1000毫升×4袋
试剂6 Tween 20 1.5毫升
A盒 防脱载玻片(50张/盒) 1盒
B盒 硅化盖玻片(100片/盒) 1盒
1.3 储存和保质期
─ 所有试剂2-6℃保存,稀释后的PBS溶液2-6℃保存
─ 请按照说明书要求使用和保存试剂,可保证试剂盒在有效期内的稳定性
1.4 注意事项
─ 使用前请仔细阅读产品说明书,不要使用已经过期的试剂
─ 使用前,请将所有的试剂恢复至室温(20-25℃),探针在使用前请混匀
─ 实验中应避免RNA酶污染,直到杂交步骤完成。应带手套操作,使用新鲜二甲苯及乙醇溶液。
─ 请勿将试剂盒中的产品用其它厂商的产品替代
1.5预先准备的试剂
PBS配制:将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水,彻底溶解后加入Tween 20 5滴,混匀后使用。
DAB工作液配制:在1毫升4A中加入50微升的4B,临用前配制,未用完的液体应弃去。也可按照上述比例,根据实际需要量配制。
检测步骤:所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行,避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始,玻片不能干燥。
2.1样品的收集和预处理
石蜡切片:
常规福尔马林缓冲液固定,时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65℃。4-6μm的石蜡切片,56-60℃烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用,也可放置于室温条件下保存(至少可保存3个月以上)。在做原位杂交之前,切片需经新鲜二甲苯脱蜡(10分钟×2)。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后,经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。
细胞样品:
将细胞滴在防脱处理过的玻片上,应保证样品是单层细胞,室温干燥30分钟,用交联固定剂(如4%多聚甲醛)室温固定细胞10分钟,PBS冲洗,逐级乙醇脱水,空气干燥,进行酶处理。
冷冻切片:
将6μm厚的冷冻切片置于处理过的玻片上,干燥30分钟,用交联固定剂(如4%多聚甲醛)室温固定10分钟,PBS冲洗,逐级乙醇脱水,空气干燥,进行酶处理。
2.2酶处理(避免RNA酶污染,带手套操作)
将对照组和实验组切片放置于37℃中,每张切片加入300-400μl的胃酶工作液孵育。注意:石蜡切片孵育30分钟,细胞样品和冷冻切片孵育10分钟;各种切片所用的胃酶工作液浓度不一样。
弃去胃酶工作液后,逐级酒精脱水(70%、95%和100%),每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。
2.3杂交程序(避免RNA酶污染,带手套操作)
杂交:
混匀探针溶液,在每张切片上加10-20μl适量的探针(试剂2,加盖盖玻片(注意防止气泡!)。湿盒中37℃孵育2小时,杂交过夜效果更好。
冲洗:将切片浸入PBS缓冲液中10分钟,直到盖玻片自然脱落,用PBS缓冲液冲洗切片2分钟×3次,取出切片,擦干多余的缓冲液。
2.4检测和显色程序
切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(试剂3),37℃孵育30分钟,PBS冲洗1分钟×3次(期间可摇动容器数次),用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟×1次。
擦净切片边缘的水分,加入适量配制好的DAB工作液。显色5-15分钟,注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟×3次后,即可进行封片或复染。
2.5复染程序
可选择苏木素复染,染色约5-10秒。用蒸馏水或去离子水短时间冲洗,常规脱水、透明,封片。
结果评判:首先应观察同次所做的阳性对照和阴性对照结果。
─ 阴性对照片应为阴性结果,无任何显色。如果有阳性结果,则本次实验结果无价值。
─ 阳性对照片应为阳性结果,而且阳性部位应与靶RNA所在的核部位一致。
在实验组切片中,首先应在低倍镜下找到阳性部位观察:
─ 阳性部位是否位于所检测的病毒易于感染的细胞中
─ 阳性显色是否正确,无内源性或福尔马林着色
常见问题处理对策:1 脱片:
可能原因 对 策
标本制作 固定剂是否选用福尔马林缓冲液,切片是否确实干片。
组织切片过薄 切片合适的厚度为4-6μm
玻片使用不当 必须使用有机硅包被的玻片
胃酶浓度过高 确定是否按照组织类型使用合适的酶浓度
消化时间过长 减少消化时间或消化温度改为室温
2 预想的阳性切片,实验结果为弱阳性或阴性
可能原因 对 策
组织固定 固定剂只能选用福尔马林缓冲液
脱蜡 选用新鲜的脱蜡液
消化
确定胃酶使用的浓度是否正确
确定酶消化的温度是否为37℃
杂交程序 确定探针在使用前是否混匀
检测程序 确定温度是否为37℃
靶DNA含量过低 可以选用过夜杂交
3 阴性对照切片阳性染色
可能原因 对 策
干片 应在湿盒中进行杂交
阳性对照探针/特异性探针污染 确定为新使用探针
4 非特异性背景染色
可能原因 对 策
干片 在潮湿的环境中进行杂交
内源性过氧化物酶 酶消化前用3% H2O2溶液室温孵育15分钟以灭火内源性过氧化物酶
实验步骤指南:石蜡切片预处理 孵育时间
1、4-6μm切片,用处理过的切片捞片
2、烤片 56-60℃ 2-16小时
3、新鲜二甲苯脱蜡 2×10分钟
4、100%乙醇后空气干燥 5分钟
酶处理(避免RNA酶污染)
1、每张切片滴加足够量的滴加胃酶工作液 37℃,30分钟
2、弃去胃酶工作液,逐级酒精脱水、空气干燥 3×1分钟
杂交程序
1、10-20μl探针/切片,加盖玻片,杂交 37℃ 16小时
2、切片插入PBS缓冲液中以便去掉盖玻片 10分钟
3、PBS缓冲液洗 3×2分钟
检测和染色程序
1、每张切片加入适量酶结合物(试剂3) 37℃ 30分钟
2、PBS缓冲液冲洗 3×2分钟
3、去离子水冲洗后,每张切片加入适量的DAB工作液,暗处孵育 5-15分钟
4、弃去显色液,蒸馏水或去离子水冲洗,根据需要复染,脱水、透明、封片
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